Beschreibung

• Die ATP Synthase (FOF1) von Escherichia coli koppelt die Translokation von Protonen über die innere Membran durch FO an die ATP Synthese/Hydrolyse in F1. In der ersten Förderperiode konnten wir zeigen, dass der aus 22 membranintegralen und peripheren Proteinen bestehende FOF1 Komplex in modularer Form aus Subkomplexen assembliert wird. Überraschenderweise, ist die F1 Untereinheit delta während der Biogenese von FOF1 maßgeblich an der Bildung von stabilem FO beteiligt. Delta wirkt als Klammer zwischen den Subkomplexen a-b2 und c10-alpha3-beta3-gamma-epsilon und garantiert, dass ein offener Protonenkanal nur begleitend im gekoppelten FOF1 Komplex gebildet wird, wodurch die für die Vitalität essentielle niedrige H+-Permeabilität der Membran erhalten bleibt.In der zweiten Förderperiode verfolgt das Projekt drei Hauptziele:I. Untersuchung der molekularen Interaktionen, die die Bildung der H+-translozierenden Einheit während der Assemblierung ermöglichen. Insbesondere die durch delta getriggerte Interaktion zwischen a-b2 und c10, aber auch die Konformation der zwei Halbkanäle der Untereinheit a im a-b2 Subkomplex und das Eintreten von delta in den Assemblierungsprozess sollen auf molekularer Ebene im Detail untersucht werden. Methodisch sollen dabei das neu entwickelte zeitverzögerte in vivo Assemblierungssystem, Nachbarschaftsanalysen durch Disulfidbildung, Cystein-Zugänglichkeitsstudien bzw. die Affinitätsreinigung von Subkomplexen unter Verwendung von Mutanten, die unterschiedliche Kombinationen an FOF1 Untereinheiten synthetisieren, eingesetzt werden. II. Untersuchung der Assemblierung des ATP-hydrolysierenden Subkomplexes alpha3-beta3-gamma-(delta)-epsilon im Cytoplasma, dem letzten noch fehlenden Teilstück des Assemblierungsweges. Besonderes Augenmerk gilt hierbei der Bildung des alternierenden alpha3-beta3 Hexamers aus den Einzeluntereinheiten. Dazu sollen die experimentellen Werkzeuge entsprechend angepasst und durch Cystein-basierte in vivo Quervernetzung ergänzt werden.III. Identifikation von an der FOF1 Assemblierung beteiligten Chaperonen. Zumindest bei Na+-pumpenden ATP Synthasen ist AtpI an der Oligomerisierung des Rotor-Rings beteiligt. Aus diesem Grund soll die Interaktion von AtpI mit c sowohl in E. coli als auch in Acetobacterium woodii untersucht werden. Außerdem, ist eine monovalente fluoreszente Markierung des Rotor-Rings von A. woodii möglich und erlaubt so die dynamische Visualisierung der in vivo Interaktion zwischen c und AtpI mittels hochauflösender Mikroskopie (FPALM). Weitere Chaperone und gleichzeitig auch Proteasen, die am Gesamtumsatz von FOF1 beteiligt sind, sollen mithilfe der in vivo Quervernetzung bzw. der BioID-Biotinylierung nach Affinitätsreinigung mittels Massenspektrometrie identifiziert werden. Eine spezifisch zugeschnittene Charakterisierung der interagierenden Partner schließt sich an. Als Gesamtergebnis wird ein detailliertes Bild des Assemblierungsweges der ATP Synthase von E. coli erwartet.

Projektlaufzeit

• 01.10.2014 - 31.05.2019