Beschreibung

• Das neu entdeckte Drei-Komponenten System HbpS-SenS-SenR schützt Streptomyces reticuli vor oxidativen Stress-basierten Ereignissen und ist in den Genomen von Streptomyceten und anderen Actinobakterien kodiert. HbpS ist ein neuartiges Eisen- und Hämbindeprotein, bildet ein Oktamer und interagiert mit der Sensorkinase SenS. Basierend auf physiologischen und genetischen Untersuchungen, der Aufklärung der 3D-Kristallstruktur sowie Proteindynamik-Studien (FRET und EPR) konnten wir nachweisen, dass in Gegenwart von Fe2+/H2O2 strukturelle Veränderungen innerhalb des HbpS-Oktamers erfolgen. Eine folgende Kaskade führt zur Autophosphorylierung der Sensorkinase SenS, die wiederum den Antwortregulator SenR phosphoryliert. Dieser reguliert die Transkription eines Operons, das die Katalase-Peroxidase CpeB kodiert, die das Bakterium vor oxidativem Stress durch den Abbau von H2O2 schützt. Basierend auf Mutantenanalysen und der 3D-Kristallstruktur von HbpS wurden drei Eisenbindemotive D/EXXE identifiziert: zwei auf der Oberfläche und eines im Inneren des Oktamers. Diese Motive sind notwendig, um hohe Mengen von Fe2+ Ionen (~100/Oktamer) zu akkumulieren, die wiederum durch HbpS zu Fe3+ oxidiert werden. Aufgrund unserer erzielten Ergebnisse werden wir Bedingungen verfeinern, um Kristalle des Wildtyps und anderer HbpS-Mutantenproteine in Abwesenheit oder Gegenwart von Häm-Typ B zu erhalten; diesen haben wir als spezifischen Ligand von HbpS identifiziert. Basierend auf den Vergleichen der gewonnenen 3D Kristallstrukturen werden sowohl Aminosäure-Reste identifiziert, die mit Häm B interagieren, als auch mögliche lokale Veränderungen analysiert, die durch die Interaktion mit Häm B im HbpS-Oktamer ausgelöst werden. HbpS ist nicht nur in der Lage Häm zu binden, sondern auch dieses abzubauen. Um den katalytischen Mechanismus aufzuklären, werden die Reaktionsprodukte des Häm-Abbaus zur Homogenität aufgereinigt und anschließend deren Strukturen analysiert. Diese Studien werden durch weitere Analysen mit Hilfe von generierten HbpS-Mutantenproteinen ergänzt, die eine veränderte katalytische Aktivität aufweisen. Es ist bemerkenswert, dass ein wesentlicher Anteil von HbpS einer Protein-Domäne unbekannter Funktion (genannt DUF336) entspricht. Diese ist in zahlreichen Proteinen aus Bakterien (4803x), Archaea (67x) und Eukaryonten (199x) zu finden. Die Ergebnisse unserer Studien werden deshalb wichtige Implikationen haben.

Projektlaufzeit

• 01.05.2014 - 31.03.2016

Ergebniszusammenfassung

• We have discovered the Streptomyces three-component system HbpS-SenS-SenR in which the extracellular protein HbpS has an octameric assembly and modulates the activity of the sensor kinase SenS. Having purified the wild-type HbpS and a designed mutant proteins, we obtained high resolution 3D crystal structures showing an octameric assembly of HbpS. Analyses of HbpS-heme binding kinetics support the role HbpS as a heme-sensor and suggested a role in heme transport. Sequence comparisons suggested that HbpS may bind a cobalamin. UV-visible spectroscopy confirmed binding to aquo-cobalamin, but not to other cobalamins. Additional mutational studies allowed the identification of the histidine residue interacting with this compound. HbpS and corresponding close and distant homologues (>10000x) comprise the DUF336 domain either alone or in fusion with other protein domain(s), i.e. PduO. This is a two-domain protein, involved in 1,2-propanediol utilization in the pathogenic Gram-negative bacterium Salmonella enterica, is an ATP:Cob(I)alamin adenosyltransferase but this is a function of the N-terminal domain alone. The role of its C-terminal domain (PduOC) was until now unknown. We showed that PduOC binds heme in vivo. The structure of PduOC co-crystallised with heme was solved (1.9 Å resolution) showing an octameric assembly with four heme moieities. The four heme groups are highly solvent-exposed and the heme iron is hexacoordinated with bis-His ligation by histidines from different monomers. Static light scattering confirmed the octameric assembly in solution, but a mutation of the heme-coordinating histidine caused dissociation into dimers. Isothermal titration calorimetry using the PduOC apoprotein showed strong heme binding (Kd = 1.6 × 10^-7 M). Additional, physiological studies suggest that PduOC:heme plays an important role in the set of cobalamin transformations required for effective catabolism of 1,2-propanediol. The HbpS protein family includes redox-active proteins that interact with the tetrapyrroles heme and cobalamin. Are these protein able to interact with other pyrrole-based secondary metabolites? Are these interactions part of novel signalling networks? Finding of answers these questions will be highly relevant for Streptomycetes as well as for other microorganisms.