Beschreibung

• Die Entstehung von peroxisomalen Translokons für Matrixproteine ist ein mehrstufiger Prozess, der durch die Bindung von gefalteten Kargo-Proteinen an zytosolischen Rezeptoren eingeleitet wird. Es wird angenommen, dass die Assemblierung von Translokons hauptsächlich durch Wechselwirkungen der Rezeptoren mit peroxisomalen Phospholipiden und Pex14p, entweder gleichzeitig oder nacheinander, zu Stande kommt. In der ersten Förderperiode haben wir die Interaktionen zwischen Rezeptoren und Kargo-Proteinen, PEX14 und Phospholipiden charakterisiert. Darüber hinaus haben wir Methoden etabliert, die es uns ermöglichen, einzelne Stufen der Translokon-Assemblierung in räumlicher und zeitlicher Auflösung zu analysieren. Für die nächste Förderperiode haben wir uns folgende Ziele gesetzt:A. Die Aufklärung der Rolle der Phospholipidbindung von PTS-Rezeptoren B. Die Entschlüsselung der Funktion von PEX14 bei der Porenentstehung C. Die Bestimmung der Bedeutung von PEX19 bei der Assemblierung der Pore D. Die Charakterisierung von Pex5p Subkomplexen an der peroxisomalen Membran, die möglicherweise als Metabolitentransporter fungieren Im ersten Projektteil bestimmen wir die Lipidinteraktionsbereiche des humanen PTS1-Rezeptors mit Hilfe von NMR und untersuchen, wie dadurch die Konformation, Dynamik und molekulare Wechselwirkungen moduliert werden. Die Bedeutung dieser Bindestellen für die Assemblierung der funktionellen Pore wird durch zielgerichtete Mutagenese und Insertion der mutagenisierten Rezeptoren in -Horizontal Lipid Bilayers- (HLB) untersucht. Die physiologische Bedeutung von Lipid-Interaktionen wird zudem durch Expression von PEX5-Varianten in PEX5-defizienten Zellen validiert.Im zweiten Projektteil werden die genannten Methoden verwendet, um die Funktion der bekannten PEX14-PEX5 Interaktionsstellen nach ortspezifischer Mutagenese in vitro und in vivo zu analysieren. Hier werden sowohl die WxxxF/Y-ähnlichen Motive im N-Terminus als auch die C-terminale Bindestelle in PEX5, die in dieser Förderperiode neu identifiziert wurden, untersucht. PEX19, der Rezeptor für peroxisomale Membranproteine, bindet PEX5-kompetitiv an PEX14. Im dritten Projektteil soll der Einfluss beider Proteine auf die Assemblierung des Translokons mit Hilfe von HLB- und NMR Experimenten untersucht werden. Die Ergebnisse dieser Analysen können erklären, wie die Importwege von peroxisomalen Matrix- und Membranproteinen mechanistisch miteinander verknüpft sind.Der vierte Projektteil adressiert die Frage, ob Pex5p-haltige Poren auch nicht-proteinogene Moleküle translozieren und in diesem Zusammenhang mit assoziierten gefalteten Enzymen über längere Zeit oder sogar dauerhaft assoziiert bleiben. Obwohl die Existenz spezifischer Metaboliten-Transporter in der peroxisomalen Membran gezeigt worden ist, konnten viele bislang noch nicht identifiziert werden. Ein Pex5p-Subkomplex an der peroxisomalen Membran von Hefen scheint ein idealer Kandidat für diese Fragestellung zu sein.

Projektlaufzeit

• 01.05.2013 - 30.04.2016

Verbund/Partnerorganisation

• Ruhr-Universität Bochum - Institut für Biochemie und Pathobiochemie - Abteilung für Systembiochemie, Technische Universität München (TUM) - Department Chemie - Lehrstuhl für Biomolekulare NMR-Spektroskopie