Beschreibung

• Autophagie ist ein essenzieller katabolischer Prozess, der die zelluläre Organellen- und Proteinhomöostase kontrolliert. Während die beteiligten Atg Protein identifiziert und teilweise charakterisiert sind, ist ihr Wechselspiel bei der Bildung und dem Verschließen von Autophagosomen vor deren Fusion mit dem Lysosom/der Vakuole ungeklärt. Ebenso ist es bisher unklar, wie Autophagosomen fusionskompetent (reif) werden, und wie Atg Proteine diesen Prozess möglicherweise kontrollieren.Basierend auf verschiedenen nicht publizierten Beobachtungen, inklusive der Charakterisierung von Atg-Proteinkomplexen und einem neuen Autophagosomen-Vakuolen Fusionsassay, planen wir Experimente, um Schlüsselschritte bei der Bildung von fusionskompetenten (reifen) Autophagosomen mit Hilfe des Hefesystems zu klären. Zunächst werden wir dafür die Reinigung von Autophagosomen optimieren, deren Lipid- und Proteinzusammensetzung bei verschiedenen Hungerbedingungen und in verschiedenen Atg Mutanten mittels Massenspektrometrie klären und deren Ultrastruktur analysieren. In weiteren Experimenten werden wir die Bedingungen der Fusion von Autophagosomen mit Vakuolen in einem neuen Fusionsassay klären. Dazu zählt die Analyse der Rekrutierung der Rab GTPase Ypt7 mit Hilfe des GEFs Mon1-Ccz1, die Klärung der beteiligten SNAREs sowie deren Verteilung, und deren Wechselwirkung mit dem vakuolären HOPS Komplex. Schließlich werden wir die Funktion von Atg Proteinen bei der Bildung und dem Verschluss von Autophagosomen klären. Zunächst werden wir das Wechselspiel der Proteinkomplexe in Lösung und auf Membranen in Gegenwart oder Abwesenheit von Atg8 analysieren. In weiteren Versuchen werden unreife Autophagosomen/Isolationsmembranen als Modell genutzt, um die mögliche Komplementation durch gereinigte fehlende Atg Proteine zu testen und damit Einblicke über deren Reifung zu erlangen. Alle Versuchsansätze werden durch parallele elektronenmikroskopische Analysen der Autophagosomenmorphologie begleitet. Wenn möglich, werden neue Mutanten auf Autophagiedefekte hin in vivo analysiert. Strukturelle Analysen komplettieren die in vitro Tests zu Atg Proteinkomplexen. Dieser mechanistische und Organellen-basierte Ansatz sollte wichtige neue Einblicke zum Verständnis einzelner Atg Proteine bei der Biogenese und Reifung der Autophagosomen ermöglichen.