Beschreibung

• Tethering-Komplexe sind wesentlich für die Biogenese von Organellen und integrale Bestandteile der zellulären Fusionsmaschinerie verantwortlich. Sie binden an Vesikel und Organellen, was ihre Assoziation ermöglicht, und binden und assemblieren SNAREs, um die Fusion von Membranen zu fördern. HOPS ist der einzige Tethering-Komplex, für den es einen funktionellen Test gibt, doch seine Rolle bei der Fusion bleibt spekulativ, da keine detaillierten strukturellen Erkenntnisse vorliegen. Hochauflösende Strukturdaten würden die fehlenden mechanistischen Erkenntnisse liefern, um die Rolle von Tethering-Komplexen auf makromolekularer Ebene zu entschlüsseln. Angesichts der hohen Flexibilität solcher Komplexe sind alle Versuche, strukturelle Informationen mit hoher Auflösung zu erhalten, gescheitert. Hier kombinieren wir verbesserte Reinigungstechniken und Liposomen-basierte funktionelle Assays (Labor Ungermann) mit neuartigen strukturellen Ansätzen in der Elektronemikroskopie (Labor Moeller), um die hochauflösende Struktur von HOPS zu klären. In Aim 1 werden wir uns auf die biochemische Optimierung von HOPS konzentrieren, um eine anschließende hochauflösende Analyse mittels Kryo-EM zu ermöglichen. In Aim 2 werden wir durch Strukturanalysen untersuchen, wie HOPS mit seinen Liganden (Ypt7, SNAREs, AP-3) interagiert. In-vitro-Rekonstitutionsansätze wie Tethering- und Fusionsversuche werden begleitet von (i) Mutantenkomplementierung in Hefe, und (ii) Analyse mutierter HOPS-Komplexe mit beeinträchtigter Rab- und SNARE-Bindungsfähigkeit, um die Schlussfolgerungen und Ideen aus unseren Strukturanalysen zu validieren. In Aim 3 werden wir die HOPS-Konformationen auf und zwischen Membranen mit Hilfe von Liposomen und Nanodiscs analysieren, um schließlich aufzudecken, wie HOPS an Membranen funktioniert.

Projektlaufzeit

• 01.01.2023 - 31.12.2025